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人血管內皮細胞生長因子A（VEGF-D）說明書
發布時間： 2010/8/14 點擊次數： 945次提 供 商： 研域（上海）化學試劑有限公司 資料大小： 圖片類型： 下載次數： 0 次 資料類型： 瀏覽次數： 945 次 相關產品： 詳細介紹： 人血管內皮細胞生長因子A（VEGF-D）
ELISA 檢測試劑盒
本試劑僅供研究使用 標本：血清或血漿
試驗原理：
VEGF-D試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知VEGF-D濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將VEGF-D和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中VEGF-D的濃度呈比例關系。
試劑盒內容及其配制：
試劑盒成份
96孔配置
48孔配置
96/48人份酶標板
1塊板（96T）
半塊（48T）
塑料膜板蓋
1塊
半塊
標準品：800pg/ml
1瓶（1.0ml）
1瓶（0.5ml）
空白對照
1瓶（1.0ml）
1瓶（0.5ml）
標準品稀釋緩沖液
1瓶（8.0ml）
1瓶（4.0ml）
生物素標記的抗VEGF-D抗體
1瓶（8.0ml）
1瓶（4.0ml）
親和鏈酶素-HRP
1瓶（12ml）
1瓶（6.0ml）
洗滌緩沖液
1瓶（20ml）
1瓶（10ml）
底物A
1瓶（6.0ml）
1瓶（3.0ml）
底物B
1瓶（6.0ml）
1瓶（3.0ml）
終止液
1瓶（6.0ml）
1瓶（3.0ml）
自備材料：
1． 蒸餾水。
2． 加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。
3． 振蕩器及磁力攪拌器等。
樣品收集、處理及保存方法：
1、 血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、 細胞上清液---1000×g離心10分鐘除顆粒和聚合物。
4、 組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液
5、 保存------如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
操作注意事項：
l 試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。
l 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。
l 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
l 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
l 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
l 底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
l 加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
l 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。
安全性：
1． 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。
2． 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。
試劑的準備：
1． 標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：
800
pg/ml
（6號標準品）
原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
400
pg/ml
（5號標準品）
100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液
200
pg/ml
（4號標準品）
100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液
100
pg/ml
（3號標準品）
100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液
50
pg/ml
（2號標準品）
100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液
25 pg/ml
（1號標準品）
100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液
0 pg/ml
（空白對照）
原始濃度不用稀釋直接加入50ul。
2． 洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。
試劑盒性能：
1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。
2. 特異性：不與其它細胞因子反應。
3. 重復性：板內、板間變異系數均小于10%。
操作步驟：
1． 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產生加樣上的誤差。
2． 根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔。
3． 加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘。
4． 甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
5． 每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6． 甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
7． 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。
8． 取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果。
9． 在450nm波長處測定各孔的OD值。
結 果 判 斷 與 分 析：
1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的VEGF-D標準品濃度為橫坐標（X），做得相應的曲線，樣品的VEGF-D含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度, 再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。
3、檢測值范圍：0-800pg/ml
4、敏感度： 0.1 pg/ml
5、正常參考值：＜351.7pg/ml
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